Живое свечение ферментов


Больше года назад коллектив кафедры биофизики ИФБиБТ СФУ во главе с доктором биологических наук, профессором Валентиной Александровной КРАТАСЮК получил грант Российского научного фонда на реализацию проекта, связанного с разработкой новой методологии комплексного мониторинга загрязнения почв. Помимо преподавателей к теме активно подключились студенты, магистранты и аспиранты кафедры. Грант рассчитан на три года — ежегодно 5,5 миллионов рублей идёт на исследования. Итогом должно стать создание научной основы и экспрессного метода для оценки степени загрязнения и качества почв.

Несколько лет назад на кафедре была разработана платформенная технология для измерения токсичности различных сред. Вначале её апробировали на водных экосистемах, измеряли загрязнение воды. А так как технология оказалась очень продуктивной и эффективной, то её стали применять и для измерения загрязнения воздуха, фруктов, овощей и даже в медицине — потому что токсины появляются в слюне, в крови и в других биологических жидкостях. Постепенно добрались и до почвы — тема для Красноярского края чрезвычайно актуальная. В соответствии с оценкой качества почв, выполненной в 2013 году Почвенным институтом им. В.В. Докучаева (Москва, РАН), Красноярский край отнесён к наиболее неблагоприятным регионам России: около 80% всей его территории занимают почвы, непригодные для аграрного производства.

В процессе работы по гранту партнёрами учёных СФУ стали Россельхознадзор, Федеральный исследовательский центр КНЦ СО РАН, МГУ и другие.

— В регионе остро стоит проблема загрязнения почв водорастворимым фтором, — говорит доктор сельскохозяйственных наук, заместитель директора Красноярского научно-исследовательского института сельского хозяйства ФИЦ КНЦ СО РАН по научной работе Александр Артурович ШПЕДТ. — Это соединение относится к первому классу опасности, вызывает флюороз — заболевание, при котором выпадают зубы, нарушается кожный покров и т.д. Так, с 1995 года средневзвешенное содержание водорастворимого фтора в почвах сельскохозяйственных угодий почти в три раза превысило ПДК, в настоящее время в разной степени загрязнено более 129 тысяч гектаров.

Когда кафедра биофизики СФУ получила грант РНФ, меня как почвоведа пригласили к участию в этой работе. Дело в том, что почва настолько сложная полифазная система, что выявить в ней какие-то загрязнения весьма проблематично. Все существующие сегодня методы мониторинга достаточно трудоёмкие и, как правило, определяют только какой-то конкретный показатель загрязнения. В большинстве своём они экономически затратные — любой анализ одного образца стоит несколько сотен рублей. А здесь, в лаборатории, рождается новая экономичная методология, основанная на биолюминесценции. Этот метод позволяет зафиксировать негативное влияние на почву как на живой объект разнообразных загрязняющих веществ (по-научному — поллютантов) путём определения влияния экстрактов почвы на ферментативные системы, активность которых измеряется биолюминесцентным методом.

На кафедре, в лаборатории биолюминесцентных биотехнологий, беседуем с аспиранткой Елизаветой БАЙГИНОЙ. Темой мониторинга загрязнения почв девушка занимается шестой год.

— Можно сколько угодно проверять то, что на почве вырастает — фрукты, овощи, а толку? Гораздо интереснее заглянуть вглубь и понять, от чего всё идёт и можно ли контролировать эти процессы? — рассуждает Елизавета. — Проблем много. Пестициды и ряд других веществ, содержащихся в почве, можно проверить химическим способом, но много таких соединений, состав которых мы даже не знаем и не можем понять, чем испорчена данная почва. Неплохо было бы найти такой универсальный метод, который бы выявлял, вредное это вещество для человека или нет. Даже если не понятно, что это за примесь — всё равно был бы первичный сигнал, после чего можно стучать во все службы, мол, проверяйте. Сейчас в рамках гранта РНФ работаем над созданием комплексного универсального биотеста, который помог бы экстраполировать результаты, полученные при ферментативном анализе, на человека. В широко применяемых сейчас биотестах, изучающих влияние токсичных сред на разные функции простейших живых организмов, не понятен ответ на вопрос — будет ли человек чувствителен к дозе, которая убивает, к примеру, инфузории?

Идея нового комплексного биотеста — не использовать целые организмы, а брать ферментативные системы, выделенные из этих организмов и отвечающие за ключевые функции — пищеварительные, дыхательные и другие. В отличие от обычных биотестов это будет комплексный ферментативный тест.

Если в почве содержатся токсические вещества, активность ферментов падает в зависимости от их количества.

Ферментативная модель организма — это выход на молекулярный уровень биотестирования, оригинальная разработка кафедры, на основе которой сформировалось целое научное направление во главе с профессором В.А. Кратасюк.

— Во-первых, это даёт упрощение анализа, ведь мы используем фермент, а не живой и капризный организм, — разъясняет тонкости нового метода Валентина Александровна. — Во-вторых, имеем увеличение точности измерения, потому что это, опять же, реагент, а не живой организм, который может по-разному себя вести. В-третьих, поскольку реагент мы готовим путём иммобилизации (он дозирован, предназначен на одно измерение и хранится около 5 лет), это упрощает работу, так как нет необходимости заниматься поддержанием культур живых организмов. И ещё об одном важном достоинстве метода. Например, в коммунальных стоках очень много органики, а если туда поместить тех же парамеций, они просто начинают этим питаться и вместо того, чтобы погибать — процветают. А наш метод фактически единственный (!), который показывает загрязнение воды при высоком содержании органических веществ.

Работая по гранту, учёные столкнулись с рядом трудностей. Очень непросто было найти эталонные образцы — чистую и грязную почву. Пришлось выезжать в деревню Минино, посёлок Элита, в пойму реки Енисей… Брали чернозём, песок, суглинок из разных экологически чистых мест. На сегодняшний день в лаборатории собрано достаточное количество эталонных образцов, исследователи приступили к модельным опытам.

Важно понять, как сработает метод, если чистые почвы загрязнить, например, тяжёлыми металлами, пестицидами и т.д.

— Тема моей кандидатской диссертации чрезвычайно интересна; чем глубже копаешь, тем больше расширяется поле деятельности и происходит переход на качественно новый уровень, — признаётся Елизавета. — В настоящее время делаем анализ с использованием около 10 ферментов, а начинали с одной ферментативной системы, состоящей всего из двух компонентов, в том числе люциферазы (окислительные ферменты, катализирующие реакцию, сопровождающуюся испусканием света, — прим. автора). Если почва не загрязнена, то ферментативная система светится на 100%. Свечение регистрируется с помощью специального прибора — люминометра. Кстати, одно из направлений кафедры биофизики, которое идёт в тесной связке с ООО «НПП «Прикладные биосистемы» (фирмой, созданной на кафедре для коммерциализации плодов наших идей), — разработка портативных недорогих приборов люминометров, что актуально как для нашего проекта, так и для других исследователей.

С виду прибор напоминает миниатюрную сувенирную металлическую фляжку, а если открыть крышку, видишь отсек, куда помещаются небольшие кюветы. Внизу стоит датчик, который регистрирует свечение. Посредством USB-кабеля картинка передается на компьютер.

— В кюветы помещаем пробирки с ферментами, которые светятся, добавляем водную вытяжку из почвы — фильтрат, — показывает, как пользоваться прибором, Елизавета. — В этой вытяжке могут находиться разные токсиканты. У нас есть и контрольный образец — это дистиллированная вода. Измеряем свечение и сравниваем. Если разница в свечении более 20 процентов, то можно говорить о том, что в фильтрате содержатся какие-то влияющие на здоровье вещества.

Пользоваться новым видом мониторинга почв гораздо проще, чем традиционным тестированием. Анализ идёт буквально несколько минут, и тут же видно — есть загрязнение или его нет.

— Благодаря гранту я успела побывать на различных конференциях и форумах, многое повидала. Участвовала в Докучаевских молодёжных чтениях в Санкт-Петербурге, ездила в Белгород на съезд почвоведов. Принимала участие в работе молодёжного форума в Сербии, — перечисляет Е. Байгина.— Чувствуется, что для классических почвоведов наши ферментные системы — тема новая, непонятная, зато все, кто занимается биотестированием, проявляли огромный интерес к нашим докладам. Иногда задавали вопросы, которые заставляли в другом русле поработать или с иной стороны взглянуть на проблему. Всегда полезно и нужно обсуждать тему широко.

— Если наша методика будет сертифицирована и достаточно хорошо апробирована, то и учёные ФИЦ СО РАН смогут ею пользоваться, и другие исследователи, ведь в каждом крупном городе существуют агрохимические лаборатории. Допустим, у нас в Красноярске есть государственный центр агрохимической службы — им тоже методика очень даже пригодится, — добавляет А.А. Шпедт.

— Есть ли оппоненты у вашего метода?— интересуюсь на всякий случай у профессора В.А. Кратасюк.

— Конечно! — не скрывает Валентина Александровна. — Первый вопрос, который задают, — можно ли переносить с ферментов на человека эту информацию? Но здесь мы провели большую предварительную работу — изучили многие вещества, способные загрязнять почву, подобрали условия, в которых все они действуют одинаково — ингибируют (ослабляют) свечение, активность этих ферментов. Так что у нас есть хорошая фундаментальная база под исследованиями.

Сейчас испытываем новую методику в Брюсселе, в фирме, которая занимается продажей биотестов.

В октябре из Бельгии к нам приедет специалист, будем вместе проверять, как наши разработки вписываются в мировую систему биотестирования.

Вера КИРИЧЕНКО
Фото Сергея ОСИНА